Functions of Hypoxia-Inducible Factors in Zebrafish Embryo (II)

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簡歷

基本資料

Project title

Code/計畫編號

NSC93-2313-B019-014

Translated Name/計畫中文名

斑馬魚低氧誘發蛋白基因在胚胎發育時期之功能(II)

Project Coordinator/計畫主持人

Chin-Hwa Hu

Funding Organization/主管機關

National Science and Technology Council

Department/Unit

Department of Bioscience and Biotechnology

Website

https://www.grb.gov.tw/search/planDetail?id=990778

Year

2004

Start date/計畫起

01-08-2004

Expected Completion/計畫迄

01-07-2005

Bugetid/研究經費

1268千元

ResearchField/研究領域

漁業
生物技術(理)

中文摘要低氧誘發因子(hypoxia-inducible factor，HIF)為一群具有bHLH-PAS 此保守區域的基因調控蛋白，最主要的功能在調節生物體內供氧的平衡(oxygen homeostasis)。在最近的研究中，發現此低氧誘發因子參與著胚胎發育的過程，當此蛋白形成異偶合體結構(heterodimer)時，具有調控下游基因的能力。細胞內缺氧時，低氧誘發因子(hypoxia-induciblefactor，包括hif1α、hif2α、hif3α)會與另一bHLH-PAS 蛋白ARNT(aryl hydrocarbon receptor translocator，亦稱為hif-1β)形成安定的蛋白異偶合體結構，藉由辨識目標基因啟動子上缺氧感應序列(HRE，hypoxia response element)調控下游基因的表現，如VEGF、GLUT1、NOS、EPO、LDH-A，目前已知超過40 種以上的基因受到調控(Semenza, 2002)。先前，本實驗室成功的在斑馬魚(zebrafish)胚胎選殖出兩段hif 基因，包括hif1α 以及hif3α，利用RNA 全覆式原位雜交法(whole mount in situ hybridization)觀察，顯示在咽胚期兩者RNA 表現重疊出現在頭部感覺器官的耳囊、嗅基板、中腦以及後腦、髓腦。此外hif1α 在36?48hpf 會表現在軟骨性內顱(cartilaginous neurocranium)，而hif3α 會表現在咽弧(pharygealarches)的部位。綜合上述我們推測hif1α、hif3α 對於頭部頭骨的發育扮演相當重要的角色，因此我們依據hif1α、hif3α 的cDNA 序列設計合成antisense 反股之morpholino-integrated 寡核酸(MO)(Heasman, 2002; Penberthy et al., 2002; SummertonandWeller,1997)，將這些寡核酸利用顯微注射(microinjection)送入斑馬魚胚胎當中，此寡核酸會與hif1α、hif3α 之mRNA 配對進而抑制蛋白質的合成，之後注入hif1α-MO、hif3α-MO的胚胎以頭骨發育相關專一的標視基因檢視，如：nkx2.3、shh、col2a1、gsc、hoxb2、fkd6、sox9a 等，結果證明hif1α、hif3α 對頭部頭骨發育扮演重要的角色。為了進一步了解HIF1α 與HIF3α 在斑馬魚胚胎發育過程中所扮演的角色，以顯微注射的方式分別注入hif1α 與hif3α 專一性的antisensemorpholino 寡核酸(MO)於1~2cellstage 的胚胎中，干擾正常胚胎HIF1α 與HIF3α 蛋白質的表現，並以感覺器官的重要指標基因來觀察抑制HIF1α 與HIF3α 的表現後，對頭部和感覺神經系統發育的影響。在這項研究中，發現HIF1αMO 與HIF3αMO 會造成胚胎頭部發育異常的現象，包括頭部及眼睛縮小、視網膜及晶體分化不明顯、內耳的三半規管發育不正常的情形。利用各種不同的標示基因bmp4、otx1、dlx3、cyp1a1…等進行RNA 全覆式原位雜交分析，來追蹤抑制hif1α 與hif3α 基因後胚胎器官發育的過程，發現其會造成內耳發育的缺失、血管紊亂及肝臟發育受阻等現象，顯示細胞低氧訊息(hypoxiasignal)在魚類內耳與血管發育的過程中扮演了相當重要的功能。(本報告摘自鍾欣怡碩士論文) 中文摘要低氧誘發因子(hypoxia-inducible factor，HIF)為一群具有bHLH-PAS 此保守區域的基因調控蛋白，最主要的功能在調節生物體內供氧的平衡(oxygen homeostasis)。在最近的研究中，發現此低氧誘發因子參與著胚胎發育的過程，當此蛋白形成異偶合體結構(heterodimer)時，具有調控下游基因的能力。細胞內缺氧時，低氧誘發因子(hypoxia-induciblefactor，包括hif1α、hif2α、hif3α)會與另一bHLH-PAS 蛋白ARNT(aryl hydrocarbon receptor translocator，亦稱為hif-1β)形成安定的蛋白異偶合體結構，藉由辨識目標基因啟動子上缺氧感應序列(HRE，hypoxia response element)調控下游基因的表現，如VEGF、GLUT1、NOS、EPO、LDH-A，目前已知超過40 種以上的基因受到調控(Semenza, 2002)。先前，本實驗室成功的在斑馬魚(zebrafish)胚胎選殖出兩段hif 基因，包括hif1α 以及hif3α，利用RNA 全覆式原位雜交法(whole mount in situ hybridization)觀察，顯示在咽胚期兩者RNA 表現重疊出現在頭部感覺器官的耳囊、嗅基板、中腦以及後腦、髓腦。此外hif1α 在36?48hpf 會表現在軟骨性內顱(cartilaginous neurocranium)，而hif3α 會表現在咽弧(pharygealarches)的部位。綜合上述我們推測hif1α、hif3α 對於頭部頭骨的發育扮演相當重要的角色，因此我們依據hif1α、hif3α 的cDNA 序列設計合成antisense 反股之morpholino-integrated 寡核酸(MO)(Heasman, 2002; Penberthy et al., 2002; SummertonandWeller,1997)，將這些寡核酸利用顯微注射(microinjection)送入斑馬魚胚胎當中，此寡核酸會與hif1α、hif3α 之mRNA 配對進而抑制蛋白質的合成，之後注入hif1α-MO、hif3α-MO的胚胎以頭骨發育相關專一的標視基因檢視，如：nkx2.3、shh、col2a1、gsc、hoxb2、fkd6、sox9a 等，結果證明hif1α、hif3α 對頭部頭骨發育扮演重要的角色。為了進一步了解HIF1α 與HIF3α 在斑馬魚胚胎發育過程中所扮演的角色，以顯微注射的方式分別注入hif1α 與hif3α 專一性的antisensemorpholino 寡核酸(MO)於1~2cellstage 的胚胎中，干擾正常胚胎HIF1α 與HIF3α 蛋白質的表現，並以感覺器官的重要指標基因來觀察抑制HIF1α 與HIF3α 的表現後，對頭部和感覺神經系統發育的影響。在這項研究中，發現HIF1αMO 與HIF3αMO 會造成胚胎頭部發育異常的現象，包括頭部及眼睛縮小、視網膜及晶體分化不明顯、內耳的三半規管發育不正常的情形。利用各種不同的標示基因bmp4、otx1、dlx3、cyp1a1…等進行RNA 全覆式原位雜交分析，來追蹤抑制hif1α 與hif3α 基因後胚胎器官發育的過程，發現其會造成內耳發育的缺失、血管紊亂及肝臟發育受阻等現象，顯示細胞低氧訊息(hypoxiasignal)在魚類內耳與血管發育的過程中扮演了相當重要的功能。(本報告摘自鍾欣怡碩士論文) Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) is a master regulator of oxygen homeostasis that controls angiogenesis, erythropoiesis, and glycolysis via transcriptional activation of target genes under hypoxic conditions. HIF-1 is a heterodimeric complex, which is composed of a HIF-1alpha subunit and a HIF-1beta╱ARNT subunit, both of which are members of the basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS family. Under hypoxia environment, the HIF-1 binds specifically to a 5'-RCGTG-3'hypoxia-responsive element (HRE) in the promoter or enhancer of various hypoxia inducible genes, including erythropoietin, vascular endothelial growth factor, glucose transporters, and glycolytic enzymes, as well as genes involved in iron metabolism and cell survival. Recently, two forms of hif-a cDNA, zhif-1alpha and zhif-3alpha, were cloned from zebrafish (Danio rerio) embryo. The spatiotemporal expression pattern of zhif-1alpha and zhif-3alpha in the embryo were analyzed by whole mount RNA in situ hybridization. Strong signal of zhif-1alpha and zhif-3alpha transcripts are detected in head sensory organs, otic plate, midbrain and hindbrain during development. To investigate the function of these genes in head development, zhif1a and zhif3a-specific morpholino-integrated antisense oligonucleotides (MO) were. It shows that zhif1alpha- and zhif3alpha- specific MO have severe effects in cranial skeleton development. Defective cranial skeleton development is comfirmed by the expression pattern changes of various cranial-specific markers, including nkx2.3, shh, col2a1, gsc. It suggests that zhif1alpha and zhif3alpha and their related signal pathway play important role in head skeleton development. The function of HIF1alpha and HIF3alpha in fish sensory organs development is revealed by gene knock-down via microinjection of gene-specific morpholino-oligonucleotides. The hif1alpha- and hif3alpha-specific antisense morpholino-integrated oligonucleotides (MO) was injected into embryos at 1-2 cell stage. We found that both gene-specific MO had strong effects in embryonic development, such as anatomical defects in the inner ear (size and shape of otoliths, formation of the semicircular canals), small head, nasal pit and eyes, malformation of inner ears and liver. In this study, we investigate the functions of hif1alpha and hif3alpha induced abnormal inner ear and vessels. The expression pattern of markers otx1, lfabp , dlx3, and bmp4 were all disturbed by the hif1alpha- and hif3alpha-specific MO injection. It suggests that hif1alpha and hif3alpha and their related signaling pathway play important roles in inner ear and vascular development.

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